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1101无菌检查法——培养基适用性检查操作要点(中国药典2020年版四部)

发布时间: 2024-01-10

培养基的适用性检查是确定培养基质量及保证实验结果正确的前提,因此如何高效完成培养基适用性检查成为实验室关注的重点。那么,今天我和大家一起梳理、探讨无菌检查法中培养基适用性检查的实验要点及注意事项。

 

无菌检查法测试用培养基


中国药典2020版四部1101无菌检查法采用硫乙醇酸盐流体培养基(FTM)和胰酪大豆胨液体培养基(TSB)作为主要测试培养基,其中TSB替代了2010版的改良马丁培养基,这两种培养基在促微生物生长能力和微生物生长种群的广泛性上无显著性差异,但TSB在培养霉菌方面略优于改良马丁培养基,并且TSB的pH值为7.3±0.2,相较于改良马丁培养基的pH值6.4±0.2,TSB更适宜微生物的生长。


药典明确了FTM和TSB这两种培养基的适用范围:硫乙醇酸盐流体培养基是厌氧菌检查的首选培养基,同时也可用于需氧菌检查;胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需氧菌检查。即产品中可能存在的需氧菌无论被接种到哪种培养基中都能被检出。


两种培养基的成分与作用见下图:

1101无菌检查法——培养基适用性检查操作要点(中国药典2020年版四部)

1101无菌检查法——培养基适用性检查操作要点(中国药典2020年版四部)


培养基的适用性检查


1101无菌检查法所用培养基适用性检查包括无菌性检查与灵敏度检查。

       

       1、无菌性检查

标准规定:每批培养基一般随机取不少于5支(瓶),放置在每种培养基规定的温度下培养14天,应无菌生长。


注意:该部分实验意义在于证明测试所用培养基的无菌性,若无菌检查测试中有菌检出,考虑菌来源于他处。如果培养14天后仍然不能从外观上判断有无微生物生长,可取至少1mL该培养液转种至同种新鲜的培养基中,再培养4天观察结果。

 

       2、灵敏度检查

1)菌种

培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认,以保证试验菌株的生物学特性。


注意:在9203药品微生物实验室质量管理指导原则中对于菌种的要求“必要时,实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认”,在做确认时,可以是划线平板观察菌落形态,也可以做革兰氏染色、生化鉴定等。


1101无菌检查法——培养基适用性检查操作要点(中国药典2020年版四部)



2)培养基接种

取适宜装量的FTM 7支,分别接种不大于100CFU的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支,另1支不接种作为空白对照;取适宜装量的TSB 7支,分别接种不大于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接种作为空白对照。接种细菌的培养管培养时间不超过3天,接种真菌的培养管培养时间不得超过5天。


注意:该部分实验意义在于证明所用培养基的灵敏度足以检出产品中可能污染的微生物。2020版药典中对于培养基的装量没有强制要求,可以参照前一版药典中的装量要求进行配制,即FTM每管装量为12mL/支,TSB每管装量为9mL/支。但需要注意,FTM的装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层(粉红色)不超过培养基深度的1/2。在供试品接种前,培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/3。

标准要求接种菌量不大于100CFU,测试时需同步进行涂布,对具体加菌量进行计数。

 

3)结果判定

空白对照管应无菌生长,若加菌的培养基管均生长良好,判该培养基的灵敏度检查符合规定。


 1101无菌检查法——培养基适用性检查操作要点(中国药典2020年版四部)


      4)灵敏度检查结果(图示)

1101无菌检查法——培养基适用性检查操作要点(中国药典2020年版四部)



其他注意事项

为保证培养基的质量,实验室对培养基的购买应有计划,并对培养基进行外观检查,指标包括容器密闭性检查、内容物的感官检查等。培养基开瓶时应记录首次开封日期,开封后的脱水合成培养基,其质量取决于贮存条件。通过观察粉末的流动性、均匀性、结块情况和色泽变化等判断脱水培养基的质量的变化。若发现培养基受潮或物理性状发生明显改变则不应再使用。

 

 

参考资料:

1、中华人民共和国药典 2020年版 四部

2、GB4789.28-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求

3、中国药典分析检测技术指南