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制药行业中的隐形杀手-洋葱伯克霍尔德菌群

发布时间: 2023-05-19

洋葱伯克霍尔德菌群容易存活在水系统以及液体产品中,且能在有强抑菌性的产品中生长繁殖,可能增加用药人群感染和致病风险,目前美国药典将其列为吸入剂、水溶性口服制剂等制剂中不可检出的微生物,如果产品中检出该微生物,可直接将其作为不可接受微生物。


接下来我们分别介绍一下“不可接受微生物”和“洋葱伯克霍尔德菌群”。


一、不可接受微生物


《中国药典》(2020版)1107中明确规定了:“本限度标准所列的控制菌对于控制某些药品的微生物质量可能并不全面,因此,对于原料、辅料及某些特定的制剂,根据原辅料及其制剂的特性和用途、制剂的生产工艺等因素,可能还需检查其他具有潜在危害的微生物。”USP和EP中也提到“For a given preparation it may be necessary to test for other microorganisms depending on the nature of the starting materials and the manufacturing process.”


在非无菌药品的微生物控制中,其他具有潜在危害的微生物也需要加以关注,这些微生物也有可能在微生物计数或某项控制菌检验过程中被发现。《中国药典》和美国的联邦法规21CFR均提到了非药典规定的控制菌,其中有致病菌或条件致病菌,如果非无菌药品中存在足够的数量,通过用药途径可能对患者的健康产生不可接受的风险,则这类微生物叫做不可接受微生物(Objectionable microorganisms)。


而正是洋葱伯克霍尔德菌的出现促使了“不可接受微生物”概念的诞生。


二、洋葱伯克霍尔德菌群


洋葱伯克霍尔德菌群(Burkholderia cepacia Complex,Bcc)隶属于伯克霍尔德菌属,该属共有122个种,将其中表型近似、基因型存在差异的菌种进行划分,命名为洋葱伯克霍尔德菌群(Bcc),截止至2021年,已被分类命名的Bcc成员达到24个种。Bcc作为条件致病菌,能引起多种医院感染,引起败血症、心内膜炎、肺炎、伤口感染和脓肿等,且该菌在患者和患者之间具有较强的传播能力,由于其多重耐药特性,治疗相当困难。


      洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia,B.c)于1947年由康奈尔大学教授从洋葱根部分离出来,可引起洋葱根茎腐烂,最初被命名为洋葱假单胞菌。随着分子生物学鉴定技术的发展,1992 年该菌被重新分类命名为洋葱伯克霍尔德菌,洋葱伯克霍尔德菌(B.c)是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体中的革兰氏阴性杆菌,革兰氏染色结果见图1。


制药行业中的隐形杀手-洋葱伯克霍尔德菌群

图1 洋葱伯克霍尔德菌CMCC(B)23005染色镜检图片




三、洋葱伯克霍尔德菌群的检验


   在各领域现行的标准体系中,洋葱伯克霍尔德菌/群的检验方法有3 种:SN/T 4684—2016《进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法》、SN/T 4485—2016《进出口口腔清洁类产品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法》及USP<60>Microbiological examination of nonsterileproducts-test for Burkholderia cepacia complex。


      2022年11月中国药典首次颁布了《洋葱伯克霍尔德菌群检查法草案公示稿(第一次)洋葱伯克霍尔德菌群检查法》,文本中首次出现了洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基(BCCSA)。本方法中选择具有代表性的3株Bcc菌株作为培养基适用性试验和检查方法适用性试验的试验菌,分别为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)〔CMCC(B)23005〕、 新洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia)〔CMCC(B)23006〕、神秘伯克霍尔德菌(Burkholderia aenigmatica)〔CMCC(B)23010〕。


检验流程方法如图2:

制药行业中的隐形杀手-洋葱伯克霍尔德菌群

图2 洋葱伯克霍尔德菌群检验流程



四、洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基(BCCSA)


  胰蛋白胨、酵母提取物提供微生物生长所需的氮源;多数Bcc成员都可利用蔗糖和丙酮酸钠,所以将上述两种物质作为碳源;氯化钠作为渗透压稳定剂;结晶紫可抑制革兰氏阳性菌及部分真菌生长;三种抗生素的添加可有效抑制大部分革兰氏阳性菌及部分革兰氏阴性菌生长,由于Bcc的广谱耐药性,其可在该培养基上生长良好。BCCSA培养基采用酚红作为指示剂,根据其变色范围(低于6.6呈现黄色)将初始pH调整为6.2±0.2,使得空白平皿呈现黄色,如图3所示;为了保证在接种Bcc后,当菌株代谢产生碱性产物时,培养基的pH能够快速升高,并体现在其颜色变化上发挥指示作用,选择磷酸二氢钾作为pH缓冲剂;洋葱伯克霍尔德菌群在BCCSA培养基上菌落形态为:菌落呈灰白、灰粉色或土黄(棕)色,周围培养基由黄色变橘红或玫红色。在TSA上Bcc菌落呈亮淡黄色,隆起,边缘整齐至不规则。不同洋葱伯克霍尔德菌在BCCSA和TSA培养基上的菌落形态见图4-图8。


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图3:洋葱伯克霍尔德菌群选择性琼脂培养基(BCCSA) 空白平皿  



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图4:洋葱伯克霍尔德菌 Burkholderia cepacia  CMCC(B)23005


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图5:新洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cenocepacia CMCC (B)23006


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图6:神秘伯克霍尔德菌 Burkholderia aenigmatica  CMCC(B)23010


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图7:洋葱伯克霍尔德菌 Burkholderia cepacia  ATCC 25608


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图8:洋葱伯克霍尔德菌 Burkholderia cepacia  ATCC 25416


五、标准定量菌株


为了方便使用,我公司推出了《中国药典》(2020版)推荐的三株洋葱伯克霍尔德菌群定量菌株。定量菌株操作便捷,数量适宜,菌量为102-103CFU/支。具体操作流程见图9。


制药行业中的隐形杀手-洋葱伯克霍尔德菌群

图9:定量菌株操作流程


六、产品信息及列表


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洋葱伯克霍尔德菌群选择性培养基



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洋葱伯克霍尔德菌群定量菌株



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七、参考文献

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3. 纫秋. 水中魅影——洋葱伯克霍尔德菌[J].食有新意,22-23.

4. 李皇,张耀平,梁林慧. 洋葱伯克霍尔德菌在几种肠道选择性培养基上的生长比较及对VITEK 鉴定的影响[J].广西医科大学学报,2009.26(1):98-100.

5. 罗俊,王娜娜,庄意琼. 一株化妆品中洋葱伯克霍尔德菌生长特性研究[J].科技创新与应用,2022.(35):7-11.

6. 王似锦,余萌,杨美琴,周发友,马仕洪,胡昌勤.凝胶剂中1株洋葱伯克霍尔德菌的分离、鉴定与生长特性研究[J].药物分析杂志,2019,39(09):1617-1624.

7. 杨学芳,蔡蓉.蒲地蓝消炎口服液及纯化水中洋葱伯克霍尔德菌检查方法的研究[J].中国中医药现代远程教育,2022,20(01):143-145.

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10. 中华人民共和国药典:四部[S]. 2020170-171.

11. Parenteral Drug Association. Technical Report No. 67 Exclusion of Objectionable Microorganisms from Nonsterile Pharmaceuticals, Medical Devices, and Cosmetics[R].USAParenteral Drug Association20141-63.